24/07/2019

Una vez terminadas las ligaciones del nitrato a la proteína BLUE y la del plomo, el mercurio y el arsénico a la RBS, hemos realizado las PCR de colonia para comprobar que se hayan ligado correctamente. Para el caso del nitrato y el arsénico hemos utilizado VF2 y reverse externos, mientras que en el plomo y el mercurio hemos empleado el mismo forward y reverse internos. Finalmente, hemos corrido la PCR en el gel para comprobar los tamaños.

Once we have finished the ligation of nitrate to the BLUE protein and the lead, mercury and arsenic to the RBS, we have carried out the colony PCR to verify that they have been correctly ligated. In the case of nitrate and arsenic we have used external VF2 and reverse, while in lead and mercury we have used the same internal forward and reverse. Finally, we have run the PCR on the gel to check the sizes.

25/07/2019

Hoy, último día de la semana, dado que la PCR del plomo del día anterior no resultó bien, hemos decidido picar 10 colonias y realizar nuevas PCR con el plásmido del plomo. Por si no recordáis bien como se realizaba la PCR, hemos preparado los cultivos y hemos introducido una colonia en cada una de ellos. Además hemos utilizado el termociclador para crear las muestras y posteriormente correrlas en el gel de agarosa.

Tras ello, hemos pasado a realizar la digestión de todos los metales excepto la del plomo. En la del nitrato, la cual iba un paso más avanzada, se ha digerido por una parte el fragmento con el promotor, la RBS y la proteína blue y por otra, se ha abierto el plásmido con el terminador, con ECO1 Y XBA1, añadiendo la fosfatasa alcalina para evitar la religación del plásmido. En las digestiones del arsénico y al mercurio, el proceso ha sido el mismo, pero en estos casos, en lugar de poner el terminador, se han unido las proteínas amarilla y roja, respectivamente. Después, el resultado se ha corrido en el gel de agarosa para comprobar que los tamaños obtenidos en la digestión se correspondían con los esperados.

Today, on the last day of the week, due to the lead PCR of the previous day did not work out well, we have resolved to chop 10 colonies and perform new PCR with the lead plasmid. In case you do not remember how to prepare PCR, we have prepared the media and we have introduced a colony in each of them. We have also used the thermal cycler in order to create the samples, afterwards, we have left them running in the agarose gel.

After that, we have gone on to digest all metals except lead. In the nitrate, which was a bit more advanced, on the one hand the fragment has been digested with the promoter, the RBS and the blue protein and on the other, the plasmid with the terminator has been opened with ECO1 and XBA1, adding alkaline phosphatase to prevent plasmid religation. In the digestions of arsenic and mercury, the process has been the same, but in these cases, instead of putting the terminator, the yellow and red proteins have been joined, respectively. Then, the result has been run on the agarose gel to verify that the sizes obtained in the digestion corresponded to those expected.